众所周知,石油是当今现代化工业生产中最重要的自然资源之一,且在未来几十年内依然是最主要的能源以及化工原料[1].近些年,石油的大量开采及其化工产品的生产应用,给人类带来了严重的环境污染和生态破坏.目前，石化废水的处理方法主要有物理法(吸附法、气浮法、膜滤法)、化学法(电絮凝、湿式氧化法、电解氧化法、臭氧催化氧化法)及生物法(好氧法、厌氧法)[2].而生物法具有降解效果好、人力物力投入小、无二次污染等优点，且处理费用明显低于物化法，目前普遍应用于石化废水处理[3].
早在1978年,中国科学院对石油污染区域的降油微生物就进行了研究,并分离得到126株细菌和71株真菌,其中60％的细菌菌株和89％的真菌菌株具有脂酶活性[4].目前已发现约有100余属200多种微生物可以降解石油烃类,包括细菌、真菌、放线菌及藻类,其中细菌、真菌对石油的降解效果较好.由于降油细菌的数量庞大,在实际应用中主要以细菌类为主[5, 6, 7].如何提高菌株的降油率已成为生化法治理石油废水的研究热点.黄敏刚等[8]分别从新疆油田、大庆油田含油污水中分离得到2株高效石油降解菌,并对混合菌的降解效果及影响因素进行了探讨.梁生康等[9]分析了单菌株和混合菌株的降油率情况以及不同含油量对其降油率的影响，并通过模拟实验考察混合降油菌对胜利油田孤岛采油废水处理效果.史利荣等[10]对石油化工废水处理中活性污泥的微生物菌群及其降解效果进行了研究，结果表明不动杆菌属为活性污泥中的最优势菌属，芽孢杆菌属次之，且均具有较好的降解效果.本文从中国石油长庆石化公司污水处理站采集水样，对菌种进行驯化、分离纯化，筛选出优势菌种并对菌种鉴定到属.通过研究培养时间、含油量、pH、接种量及温度对降油率的影响，得出优势菌种的最优降解条件.
1 实 验咸阳市中国石油长庆石化公司污水处理站的处理能力为370m3/h,废水来源为工业废水和厂区内生活污水.根据《水和废水监测分析方法》(第四版)中水样的采集与保存方法采集水样，原油由该站提供，菌种取自该站曝气池及隔油池,用500mL的清洁无菌玻璃瓶采集活性污泥泥水混合液及污水水样[11].
1.1 培养基(1) 无机盐培养基(原油为唯一碳源) 原油,K2HPO4 2.0g,KH2PO41.5g,NH4NO3 2.0g,无水Na2SO4 0.5g,微量元素液10mL,蒸馏水1 000mL,pH值7.0~7.4,121℃高压蒸汽灭菌20min备用;固体培养基再加入15~18g琼脂.其中，微量元素液组分为MgSO4·7H2O 2g,无水CaCl2 1g,FeSO4·7H2O 1g,ZnSO4·7H2O 0.5g,CuSO4·5H2O 0.1g,蒸馏水1 000mL．
(2) 富集、纯化培养基 NaCl 5g,牛肉膏3g,蛋白胨10g,蒸馏水1 000mL,pH值7.0~7.4,121℃高压蒸汽灭菌20min备用;固体培养基再加入15～18g琼脂.
1.2 菌种的驯化、分离纯化和鉴定取2mL泥水混合液/污水水样于100mL灭菌原油无机盐培养基(原油质量浓度为1g/L)中,30℃，180±2r/min摇床振荡培养8d后取2mL上述培养液于新鲜的原油培养基(原油质量浓度逐次增加为:2，3，4g/L)中再次培养8d,如此驯化4次.通过不断提高初始含油量来强化菌株的降解性能.
取每次驯化后的菌悬液1mL在无基盐固体培养基上做稀释平板,30℃培养箱中培养3～5d后从上述培养皿中挑取生长良好的不同的单菌落,在纯化培养基上反复划线,直到得到单一菌种为止.最终分离得到2株优势石油降解细菌.
通过查阅《常见细菌系统鉴定手册》[12]并利用16S rDNA基因序列法鉴定菌种，得到GA-4为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),GA-6为不动杆菌属(Acinetobacter sp.).
2 石油降解率的测定 2.1 确定石油醚溶液标准曲线方程将原油配制成70mg/L的石油醚溶液,以溶剂石油醚为空白样进行光谱扫描,绘制扫描光谱曲线如图 1.由图 1可知原油溶液有两个吸收峰:224nm和242nm.由于在波长224nm处溶剂对吸光度有一定的干扰,吸光值无法趋于稳定,而在波长242nm处吸光值保持稳定,所以最适测定波长选为242nm.采用紫外分光光度法测定降油率[13],以石油醚为溶剂将原油配成质量浓度分别为0，10，20，30，40，50，60，70mg/L的溶液，以石油醚为空白对照，在波长242nm处测定各溶液的吸光度值分别为0，0.179,0.344,0.52,0.681,0.853,1.022,1.227.得出油含量-吸光度值曲线方程:y=0.017 3x-0.000 6,R2=0.999 4.
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| 图 1 光谱扫描曲线 Fig. 1 Spectrum scanning curves |
将纯化好的各菌种挑取一环分别接种到35mL灭菌富集培养基中,30℃，180±2r/min摇床振荡培养,根据菌种的生长曲线来确定菌剂的培养时间,一般选用对数期末期作为菌剂培养时间,此时细菌的菌体量趋于最大且代谢活力较强[14]. 将菌悬液离心分离后得到菌体,在无菌条件下用无机盐培养液将菌体调为同一吸光度值的种子菌液.
2.3 菌种降油率的测定
取种子菌液1.5mL加入到50mL原油无机盐培养基中,以不加菌的摇瓶做为空白对照,30℃，180±2r/min摇床振荡培养7d.之后加入石油醚对残余石油进行萃取，每次加入量为10mL,共萃取3次，随后将萃取液混合.采用高速离心法将萃取液在5 000r/min条件下将石油醚溶液和水分离,以去除萃取液中残余水分.用石油醚将各组萃取液调为同一容量体积,取1mL萃取液加入到50mL比色管中,加石油醚到刻度线并充分摇匀.以石油醚作为对照,在波长242nm下测定吸光度，对照标准曲线求出各菌株的石油降解率.计算公式为
\[\eta \left( {\text{%}} \right){\text{ = }}\left( {{c_0} - {c_x}} \right)/{c_0} \times 100\% \]
(1)
在富集培养基中分别接种一环GA-4菌、GA-6菌,30℃、180±2r/min摇床振荡培养,每隔一段时间测定菌剂的OD600值(溶液在600nm波长处的吸光值),利用菌体的吸光度来反应细菌培养液的浓度,见图 2.由图 2可知GA-4菌、GA-6菌分别在45h,15h达到对数期末期,所以分别选取此时作为种子菌液的培养时间.
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| 图 2 菌株的生长曲线 Fig. 2 Growth curves of strains |
经过7d摇床振荡培养后，测定不同培养时间和不同含油量条件下的降油率.由图 3可知,随着培养时间的延长菌体对原油的降油率也在不断增加,同时GA-4菌、GA-6菌的降油速度随时间延长而逐渐减慢.当初始含油量为2g/L时,GA-4菌、GA-6菌的降油效果最好,7d的降油率分别为41.18％,34.82％;而当初始含油量≥2g/L时，GA-4菌、GA-6菌的降油率则随着油浓度的增加而降低:说明当初始含油率浓度大于2g/L时，随初始含油率浓度的增加，菌体的降油率不断减小.可见高浓度的石油烃对微生物的代谢生长有抑制作用,而少量的石油污染物反而会刺激降油微生物的生长[15].
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| 图 3 不同培养时间、不同含油量时的降油率 Fig. 3 Oil drop rate under different incubation time and different oil content |
微生物对石油废水处理的最适pH值通常为中性7.0左右,也有相关文献报道很多石油烃降解菌的最适pH值偏弱碱性,略大于7.0[16].调节无机盐培养基(含油量为2g/L)的pH值分别为6.0,7.0,8.0,9.0,摇床振荡培养7d后测定不同pH值下的降油率.由图 4可知,GA-4菌、GA-6菌的最适pH值分别为8.0，7.5.此时的降油效果最好,降油率分别为44.3％，36.8％.当pH值过高或过低时,溶液中H+或OH-浓度过高,引起微生物原生质膜的电荷变化,从而降低了微生物酶的催化反应和对营养物质的吸收,最终抑制了菌体的生长繁殖,使降解率变低[17].
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| 图 4 不同pH值下的降油率 Fig. 4 Oil drop rate under different pH |
将体积浓度分别为1％,2％,3％,4％,5％,6％的GA-4菌与GA-6菌加入无机盐培养基(含油量为2g/L)中,摇床振荡培养后测定不同接种量条件下的降油率.由图 5可知当接种量小于5％时,随着菌体接种量的增加降油率也在不断增加;当GA-4菌、GA-6菌的接种量大于5％时,菌体的降油率随着接种量的增加开始降低,所以GA-4菌、GA-6菌的最优接种量为5％.
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| 图 5 不同接种量下的降油率 Fig. 5 Oil drop rate under different lation amount |
一般情况下,微生物的合适降解温度在20℃~30℃之间,在此范围内对石油烃的降解效果随着温度的提高而增大.温度过高或过低均会降低降解效果.合适的环境温度可以促进微生物体内酶促反应的快速运行,同时,温度决定了石油的物理状态,从而影响到微生物与石油碳氧化合物分子之间的相互作用,进而影响了生物降解速率.
将GA-4菌、GA-6菌加入无机盐培养基(含油量为2g/L)中.摇床振荡培养7d,温度条件为15℃,20℃,25℃,30℃,35℃,测定其降油率.从图 6可知GA-4菌、GA-6菌的最适降解温度分别为30℃，28℃.当温度小于30℃时,降油率随温度的升高增大;当温度大于30℃时,降油率随温度的升高有所减小.可能是因为随着温度的升高,水中溶解氧浓度降低,从而抑制了菌体的新陈代谢,使降油率变低.
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| 图 6 不同温度下的降油率 Fig. 6 Oil drop rate under different temperature |
以不加菌的原油无机盐培养基摇瓶为对照样.对比可以看出，GA-4菌、GA-6菌摇瓶中菌液由原来的无色透明液体变为乳黄色,说明摇瓶中的菌体浓度增大;摇瓶中的原油量减少,已无油颗粒存在,乳化效果很好,原油降解效果明显.
4 结 论(1) 通过菌种的初筛、复筛分离得到2株优势降油菌,经初步鉴定GA-4菌为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),GA-6菌为不动杆菌属(Acinetobacter sp.).
(2) 对GA-4菌、GA-6菌进行降解条件优化,GA-4菌、GA-6菌的最优化降解条件分别为:30℃,pH为8.0,接种量为5％;28℃,pH为7.5,接种量为5％.
(3) 与不加菌的摇瓶对照比较,GA-4菌、GA-6菌摇瓶中菌液由无色透明液体变为了乳黄色,摇瓶中的原油量明显减少,已无油颗粒存在,原油降解效果明显.
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