近几年癌症呈高发和年轻化发展态势, 因此对诱发癌症的机理研究越来越受到关注.致毒致癌性有机小分子与DNA结合后能显著影响DNA的转录与合成, 导致DNA发生突变, 继而引发癌症.为了满足日常分析检测的需要, 及时挽救生命, 采用简单快捷灵敏的方法研究DNA与致毒致癌性小分子物质之间相互作用十分必要.目前, 研究二者结合作用机制的方法有紫外光谱法、荧光光谱、拉曼光谱、红外光谱、核磁共振谱、X-衍射晶体、圆二色谱、瑞丽散射共振光谱、黏度与熔点测试[1-8]、经典电化学方法[9]等.然而, 紫外光谱法灵敏度低; 拉曼光谱、红外光谱定量较困难; 核磁共振谱、X-衍射晶体、圆二色谱法中所用的仪器昂贵、检测成本高; 黏度与熔点测试法只能定性; 荧光光谱和瑞丽散射共振光谱需要特殊的试剂.而只有经典电化学方法以其操作简单、成本低廉、检测周期短、易于微型化而受到广泛关注.但经典电化学方法在研究二者结合体系中, 必须有电化学活性物质参与, 这就增加了研究成本; 此外, 结合反应的动力学反应特点未被探讨.
联苯胺(BZ) 是24种致癌性芳香胺的一种.除了大量存在于水域和底泥中, 联苯胺还能够通过空气和土壤传播, 可引起膀胱癌、胆管癌等[10-11], 对环境和人类构成较大危害[12].因此研究联苯胺与DNA的结合机制就非常重要.已有极谱法[13]计算出鱼精子hsDNA与联苯胺相互作用的结合常数, 但由于极谱法的汞电极易对操作人员健康造成危害, 不适合被推广使用, 因此需要开发新的电化学方法.
双极制界面电位法, 最早也叫“零流电位法”, 是近年国内开发的一种新型界面电位传感电分析技术, 国外并没有此技术的研发.此方法简单、灵敏、稳定, 可以实时在线监测样品与界面层物质之间的作用, 制作成本低廉, 未来易于实现微型化、自动化和智能化.双极制界面电位测量系统由一个电位回路和一个电流回路组成.由于溶液的旁路电阻大于导电材料电阻, 回路电流经工作电极、辅助电极端口后仍流经导电材料.因此, 回路电流是一个直流电流, 遵守欧姆定律, 电流值取决于回路电压及电流回路的电阻.施加一定的线性扫描电位Eapp(vs.Eref) 于电极材料后, 所记录的电流I-电位Eapp曲线中，电位Eapp=Eref+E+Ψ+IR, 其中E为电极材料的电位, Ψ为电极材料双电层的界面电位, I、R分别为回路电流和回路电阻.当I=0时, 零流电位Ezcp=E=Eapp(vs.Eref)-Ψ, 因此电极材料Ψ变化, Ezcp才有相应变化[14].
目前, 应用双极制界面电位法可以计算出聚胭脂红与质子的交换速率常数[15]，人血清白蛋白在金电极表面的吸附常数[16]，半胱胺酸在金电极表面自组装过程的动力学常数[17]，抗肿瘤药物小分子贝加因与dsDNA (双链DNA) 结合常数[18]及Cu2+/Cu+配合物与甘氨酸结合作用的稳定常数测定[19]等.此外, 双极制界面电位传感系统还可通过印迹聚合物与模板分子的结合作用检测联苯胺[20]、邻甲苯胺[21]等.因此用双极制界面电位法研究物质间的作用机制既简单又灵敏.
文中以自吸附方式在价格低廉的铅笔芯(CP) 表面构筑了DNA/CP, 应用双导线制界面电位法测定了鲱鱼精dsDNA与BZ结合作用的热力学与动力学参数.本方法简单灵敏, 可进一步设计成检测BZ的传感器.
1 实验 1.1 仪器和试剂 1.1.1 仪器CHI610D型电化学工作站(上海辰华仪器厂, 上海), UV-2450紫外分光光度计(日本岛津), Quanta FEG 450 FESEM型扫描电镜(美国FEI公司).
1.1.2 试剂1.0×10-4mol·L-1联苯胺储备液(天津市科密欧化学试剂有限公司, 分析纯); 1.0 g·L-1鲱鱼精dsDNA储备液(AR, Sigma公司), 其浓度由紫外光谱260nm处的吸光度进行换算确定(ε=6 600L·moL-1·cm-1), 临用时配制; pH7.38磷酸缓冲溶液(PBS).其他试剂均为分析纯.实验所使用水均为二次蒸馏水.实验均在室温下操作.
1.2 DNA/CP的制备按照文献[16]电极方法制备CP.以自制铅笔芯(CP) 电极为工作电极, 铂丝为辅助电极, 饱和甘汞电极(SCE) 为参比电极, 在-1.00~1.00V电位范围内, 以0.1V·s-1扫速在PBS (pH7.38) 缓冲溶液中循环扫描多次对CP电极进行活化.将活化好的CP电极置入含0.1g·L-1dsDNA的PBS (pH7.38) 缓冲溶液中, 自吸附20min后, 水洗去除CP表面多余的dsDNA得到DNA/CP, 晾干保存备用.
1.3 方法 1.3.1 BZ与dsDNA结合作用的热力学按照图 1所示的连接方法, 将DNA/CP串联入CHI610D电化学工作站的工作电极端和对电极端之间, 然后与饱和甘汞参比电极(SCE) 一起浸入含一定量BZ的PBS (pH7.38) 缓冲溶液中, 静置18min后, 在-0.8~0.8V电位范围内以0.1V·s-1的扫速扫描一圈, 记录I-Eapp曲线上I=0处的电位值即零流电位Ezcp值.
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| 图 1 DNA/CP的双极制界面电位法连接示意图 Fig.1 Schematic diagram of interface potentiometry with double poles |
DNA/CP、SCE连接方法同1.3.1.电解液为4.0×10-6mol·L-1BZ的pH7.38PBS.DNA/CP、SCE浸入电解液后, 每隔2min在-0.8~0.8V电位范围内以0.1V·s-1的扫速扫描一圈并记录该时间的DNA/CP零流电位Ezcp.
每次测量后, 将DNA/CP用蒸馏水清洗后即可用于下次测量.
2 结果与讨论 2.1 BZ和鲱鱼精dsDNA的相互作用 2.1.1 DNA/CP与CP的差异图 2是裸CP与DNA/CP分别在双极制界面电位法下的I-Eapp曲线.由图 2可知, 裸CP的Ezcp为33.4mV (曲线1), 而DNA/CP的Ezcp为13mV (曲线2), 比裸CP的Ezcp负移20.4mV, 说明DNA吸附在铅笔芯表面, 其界面层与裸铅笔芯明显不同, 导致二者具有不同的界面电位, 从而产生不同的Ezcp.CP和DNA/CP的扫描电镜图(图 3) 证明了这种推断.从图 3(a)可以看出, 裸CP的表面只显示石墨的片层结构; 由图 3(b)可以看出，DNA/CP表面不仅保留了石墨的片层结构, 而且还在其表面散落有一簇簇的DNA, 说明通过自吸附方式DNA能够在石墨表面存在, 因此表面结构的差异导致了两种电极的双极制界面电位不同.
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| 图 2 CP (1) 和DNA/CP (2) 的I-Eapp曲线 Fig.2 I-Eapp curves of CP and DNA/CP |
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| 图 3 CP和DNA/CP的扫描电镜图 Fig.3 SEM of CP和DNA/CP |
考察了鲱鱼精dsDNA与BZ结合时间对DNA/CP Ezcp的影响.图 4是DNA/CP在不同结合时间的I-Eapp曲线.根据图 4中的数据(未画出18min后的I-Eapp曲线), 记录DNA/CP的Ezcp与结合时间之间的关系, 结果如图 5所示.由图 5可以看出, 在18min内, Ezcp随结合时间的增加而逐渐正移; 18min后, DNA/CP零流电位Ezcp不再变化, 说明dsDNA与BZ的结合趋于饱和.
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| 图 4 不同结合时间的I-Eapp曲线 Fig.4 I-Eapp Curves at different binding time |
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| 图 5 结合时间对零波电位Ezcp的影响 Fig.5 Effects of interaction time on Ezcp |
为了测定鲱鱼精dsDNA与BZ结合作用的动力学参数, 假定dsDNA与BZ按式(1) 结合成DNA·BZ, 即DNA+BZ=DNA·BZ.
假定dsDNA与BZ结合为一级反应, 其瞬时反应速率[22]可表示为
| $ \frac{\text{d}n}{\text{d}t}={{k}_{\alpha }}{{\left[\text{BZ} \right]}_{0}}\left( N-n \right). $ | (1) |
式中, N为与dsDNA结合的BZ分子总数, n为在时刻t时与dsDNA结合的BZ分子数, [BZ]0为溶液中BZ的初始浓度, kα为正向反应速率常数.如果BZ、DNA各自分子之间均没有明显的相互作用, 则n/N可以表示成dsDNA与BZ结合程度.以结合完全程度α代替n/N, 式(1) 可被简化为[22]
| $ \frac{\text{d}\alpha }{\text{d}t}={{k}_{\alpha }}{{\left[\text{BZ} \right]}_{0}}\left( 1-\alpha \right). $ | (2) |
分离变量并积分, 可得dsDNA与BZ结合完全程度αi与任意反应时间ti的关系为
| $ \text{ln}\left( 1-{{\alpha }_{i}} \right)=C-{{k}_{\alpha }}{{\left[ \text{BZ} \right]}_{0}}{{t}_{i}}. $ | (3) |
将未结合(t=0, 反应程度记为α=0) 时的Ezcp记作Ezcp, α=0, 完全结合时(反应程度记为α=1) 的Ezcp记作Ezcp, α=1.反应过程中任意时刻ti的反应程度αi可用简单的内插法[22]来估算, 其值为
| $ 1-{{\alpha }_{i}}=\frac{{{E}_{zcp, {{\alpha }_{i}}}}-{{E}_{zcp, \alpha =1}}}{{{E}_{zcp, \alpha =0}}-{{E}_{zcp, \alpha =1}}}. $ | (4) |
将式(4) 代入式(3) 得
| $ \ln \frac{{{E}_{zcp, {{\alpha }_{i}}}}-{{E}_{zcp, \alpha =1}}}{{{E}_{zcp, \alpha =0}}-{{E}_{zcp, \alpha =1}}}=C-{{k}_{\alpha }}{{\left[\text{BZ} \right]}_{0}}{{t}_{i}}. $ | (5) |
根据图 5中2min~18min的Ezcp与时间线性方程, 计算出C=0.038 24, kα为2.06×104(mol·L-1)-1·s-1.因此, dsDNA与BZ反应的表观结合速率常数kα为2.06×104(mol·L-1)-1·s-1, 半衰期为3.36×10-5s.
2.1.3 BZ和dsDNA结合常数和结合比考察了BZ浓度对DNA/CP界面电位的影响.图 6是不同BZ浓度下DNA/CP的Ezcp.如图 6所示, 随着BZ浓度的增加, DNA/CP的Ezcp逐渐正移; 且当BZ浓度在8.0×10-7~1.0×10-5mol·L-1的范围内, Ezcp与BZ浓度对数lg[BZ]呈正比关系, 结果如图 7所示.其线性方程为
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| 图 6 DNA/CP在不同浓度BZ溶液中的I-Eapp曲线 Fig.6 I-Eapp curves of DNA/CP in different concentration of BZ solution |
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| 图 7 Ezcp与lg[BZ]的线性关系 Fig.7 Relationship between Ezcp and lg[BZ] |
| $ {{E}_{zcp}}=0.195\ 4+0.041\ 14\lg \left[\text{BZ} \right]\left( r=0.998, n=7 \right). $ | (6) |
由方程(6) 计算出检测限是1.96×10-7mol·L-1(S/N=3), 因此通过双极制界面电位法监测BZ与dsDNA的结合作用, 可进一步创建检测BZ的新方法.BZ与dsDNA结合常数的计算参考文献[22].
假定dsDNA和BZ按式(7) 结合成DNA·BZm, 即DNA+mBZ=DNA·BZm, 则
| $ \beta \cdot {{\left[\text{BZ} \right]}^{m}}=\frac{\left[\text{DNA}\cdot \text{B}{{\text{Z}}_{m}} \right]}{\left[\text{DNA} \right]}. $ | (7) |
式中, m是结合比, β是表观结合常数.[DNA·BZm]为DNA与BZ结合物的浓度, [DNA]为游离DNA的浓度.
在BZ溶液中, DNA/CP双极制界面电位Ψ可用能斯特方程[22]表示为
| $ \psi =K+\frac{RT}{nF}\ln \frac{\left[\text{DNA}\cdot \text{B}{{\text{Z}}_{m}} \right]}{\left[\text{DNA} \right]}. $ | (8) |
其中, K为DNA/CP的标准电极电位等参数的常数[22].n为DNA净电荷数, 文中n=2.F=96 485C·mol-1为法拉第常数, R=8.314J·mol-1·K-1为气体常数, T为测试温度, 取T=298.15K.
由于Ezcp=Ψ+φSCE, 因此,
| $ \begin{align} &{{E}_{zcp}}=K+{{\varphi }_{SCE}}+\frac{RT}{nF}\ln \beta +m\frac{RT}{nF}\ln \left[\text{BZ} \right], \\ &{{E}_{zcp}}=K+{{\varphi }_{SCE}}+\frac{0.059\ 2}{n}\lg \beta +m\frac{0.059\ 2}{n}\lg \left[\text{BZ} \right]. \\ \end{align} $ | (9) |
文中(K+φSCE) 等于DNA/CP在不含BZ的pH 7.38PBS中的零流电位Ezcp, 测定值为0.043V.由线性回归方程斜率
用同一根DNA/CP, 按照浓度由低到高5次, 再由高到低5次的顺序, 依次测定dsDNA与浓度为(8.0, 10.0, 20.0, 40.0, 60.0, 80.0, 100.0)×10-7mol·L-1的BZ作用后的零流电位值, 其相对标准偏差均在3%之内, 说明此方法具有良好的精密度.
用5根DNA/CP, 按照浓度由低到高的顺序, 分别测定dsDNA与上述浓度范围内的BZ作用后的零流电位值.实验结果显示, 每根电极在同一浓度BZ中的零流电位基本相同, 相对标准偏差均不超过5%, 因此本方法具有良好的重现性.
3 结论在双极制界面电位法下, 由于CP表面上dsDNA与溶液中BZ的结合作用, 导致DNA/CP的零流电位发生相应的变化, 因此通过I-Eapp曲线和零流电位的变化即可实时跟踪监测二者的结合过程.据此计算出dsDNA和BZ结合作用的热力学参数, 并证明二者结合反应为一级动力学方程.本方法操作简单安全环保, 成本低, 不仅克服了传统极谱法中使用汞电极易对人体造成危害的不足, 而且还可以进一步发展为检测BZ的新方法.
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